合成用青霉素酰化酶的发酵与酶法合成头孢克洛

【摘要】青霉素酰化酶作为一种重要的医药工业用酶,在半合成∥-内酰胺抗生素和医药中间体的生产、多肽合成以及外消旋手性化合物的拆分中,青霉素酰化酶都发挥了关键作用,具有广泛的市场需求和发展前景。随着基因工程和酶工程领域不断创新与发展,研究者构建筛选出产青霉素酰化酶的高产优质基因工程菌,并且将青霉素酰化酶应用于对环境无污染,反应条件温和以及具有绝对专一性的酶法合成中,生产青霉素与头孢菌素类抗生素,与传统的化学合成法相比,可使生产成本减少10%以上。因此,获得高效发酵生产青霉素酰化酶及其固定化、转化的工艺参数,将促进其在医药、食品等产业中的应用。本研究采用重组大肠杆菌为试验菌株,研究其产酶的发酵条件和分批发酵动力学,对青霉素酰化酶的固定化及其催化合成头孢克洛的反应条件进行优化,主要结果如下：摇瓶发酵条件优化结合单因素试验和响应面分析法,对重组大肠杆菌产青霉素酰化酶的摇瓶发酵条件进行了优化。单因素试验确定最适甘油浓度、蛋白胨浓度、诱导物IPTG浓度以及发酵初始pH和发酵初始温度的范围分别为15～20g/L、15～20g/L.50μg/mL、6.5～7.5和28-36℃。采用Box-Behnken试验设计和响应面分析方法,对重组大肠杆菌产青霉素酰化酶的发酵条件进行优化,得出其最佳发酵条件：甘油浓度为20g/L,蛋白胨浓度为21g/L,发酵初始pH值为7.1,在此条件下青霉素酰化酶的平均活力达到8425.31U/L,较优化前提高了11%。发酵动力学模型建立利用5L发酵罐对重组大肠杆菌产青霉素酰化酶的发酵过程进行了放大,根据Logistic方程和Luedeking-piret方程,采用Origin8.0绘图软件对重组大肠杆菌产青霉素酰化酶发酵实验数据进行非线性拟合,建立了分批发酵生产青霉素酰化酶的菌体生长、青霉素酰化酶合成以及基质消耗动力学模型,分别如下：(1)菌体生长动力学模型(2)青霉素G酰化酶合成动力学模型(3)基质消耗动力学模型所建模型能够较好模拟了重组大肠杆菌分批发酵产青霉素酰化酶的动态过程,为工业化生产提供了可行的参考依据。青霉素酰化酶固定化条件确定通过实验比较,确定青霉素酰化酶固定化载体为国产胺基型树脂LX-1OOOHA,单因素试验和Box-Behnken试验设计相结合,对影响胺基树脂固定化青霉素酰化酶的主要因素进行优化。结果显示最佳固定化条件为：pH7.8、温度25℃、载体用量0.11g/mL、时间24h,在此条件下固定化酶活力达到229.78U/g,酶活回收率为61.66%,说明将LX-1000HA型树脂用于重组大肠杆菌产青霉素酰化酶的固定化切实可行。固定化青霉素酰化酶催化合成头孢克洛的反应体系建立在转化温度15～20℃,pH5.5-6.5时,侧链PGM-HCl与母核7-ACCA投料比为1.4,投酶量为5.5U/mL。在优化条件下,回收自制固定化青霉素酰化酶,并重复125批次试验,结果显示所有反应批次平均反应时间约138min,平均转化率96.23%。表明自制固定化青霉素酰化酶在此条件下催化合成头孢克洛的效果良好,且自身活力表达稳定性高,使用寿命长,可为规模化工业生产提供参考。
【作者】韦晓菊；
【导师】黎继烈；
【作者基本信息】中南林业科技大学，微生物学，2014，硕士
【关键词】青霉素酰化酶；重组大肠杆菌；发酵条件；发酵动力学；酶固定化；酶法合成；

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